توسعه تست آویدیته الایزا با استفاده از - دانلود رایگان
دانلود رایگان انگل توکسوپلاسما گوندی، یکی از اعضای شاخه اپی کمپلکسا، راسته کوکسیدیا، انگل اجباری درون سلولی بوده که بیماری توکسوپلاسموزیس را ایجاد می کند.
دانلود رایگان
| توسعه تست آویدیته الایزا با استفاده از پروتئینهای نوترکیب برای تمایز عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسماعنوان صفحه چکیده 1 مقدمه 3 فصل اول: کلیات 1-1- اتصال ونفوذ توکسوپلاسما گوندی به سلول 12 1-2-راه انتقال 13 1-2-1-مصرف مواد انگل آلوده به اووسیست 14 1-2-2-مصرف گوشت حاوی کیست نسجی 15 1-2-3-انتقال از طریق جفت 15 1-3- همه گیر شناسی عفونت توکسوپلاسمایی 16 1-3-1-عوامل موثر در همه گیر شناسی توکسوپلاسما گوندی 18 1-3-1-1-عوامل مربوط به انگل 18 1-3-1-2-عوامل مربوط به میزبان 18 1-3-1-3-عوامل مربوط به محیط 19 1-4-آنتي ژنهاي توكسوپلاسما گوندي 19 1-5-واکسیناسیون 21 1-6-بیماریزایی 22 1-7-توکسوپلاسموزیس مادرزادی 24 1-8-تظاهرات بالینی 25 1-9-تشخیص توکسوپلاسموز 29 1-9-1- تشخیص مستقیم 29 1-9-1-1-تشخیص هیستولوژی (بافت شناسی 29 1-9-1-2- جداسازی توکسوپلاسما گوندی 30 1-9-1-3-تکنیک واکنش زنجیری پلیمراز (PCR1-15-2-تشخیص غیر مستقیم 30 1-9-2-تشخیص غیر مستقیم 31 1-9-2-1- تست رنگی سابین – فلدمن 34 1-9-2-2- سنجش آنتی بادی فلوئورسنت غیر مستقیم 34 1-9-2-3- تست سنجش آگلوتیناسین ایمنوسوربنت 35 1-10-الایزا (ELISA) 35 1-10-1- الایزای مستقیم 36 1-10-2- الایزای غیر مستقیم 36 1-10-3- الایزای ساندویچ 37 1-10-3-1-الایزای ساندویچ مستقیم 37 1-10-3-2-الایزای ساندویچ غیر مستقیم 37 1-10-4- الایزای رقابتی یا مهاری 37 1-11-کاربرد پروتئین های نوترکیب در تشخیص توکسوپلاسماَ 38 1-12-تولید پروتئین نوترکیب 39 1-13-تشخیص سرولوژی توکسوپلاسموزیس در دوران حاملگی 39 1-14-ارزش تشخیصی ایزوتایپ های مختلف ایمونوگلوبولین اختصاصی توکسوپلاسما در تشخیص عفونت 40 1-15-کاربرد IgGAvidity در افتراق عفونت حاد از مزمن توکسوپلاسموزیس 42 1-16-درمان 44 1-17-پیشگیری 47 1-18- بيان مسئله و اهميت آن 48 1-19- دلايل انتخاب موضوع 50 1-20-اهداف و فرضيا ت 51 فصل دوم: مروری بر تحقیقات گذشته 2-1- مروری بر تحقیقات گذشته 53 فصل سوم: مواد و روشها 3-1- تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی 59 3-1-1-مکانیسم تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی 59 3-1-2- تهيه و تخليص پروتئين هاي نو تركيب rGRA7 (pUET-GRA7) و rGRA6(PUET-GRA6 60 3-2- بررسی و تائید پروتئین های تخلیص شده 62 3-2-1- بررسی و تائید پروتئین های نوترکیب GRA7 و GRA6 بوسیله آنالیز SDS-PAGE 62 3-2-2- تائيد هويت پروتئين بيان شده با روش وسترن بلات 66 3-3- دیالیز نمونه های تخلیص شده 71 3-4- تعيين غلظت پروتئين 71 3-5- سیستم های الایزا(اصول کار) 71 3-5-1- طراحی سیستم های الایزا 72 3-5-1-1- نکات تکنیکی در الایزا 72 3-5-1-2- برخی مشکلات در الایزا 74 3-6- بررسی پتانسیل PUET-GRA7 و PUET-GRA6 در تشخیص عفونت حاد و مزمن توکسوپلاسموز با روش الایزا 76 3-6-1-برقراری شرایط الایزا 76 3-6-2- استفاده از لیزات باکتری در الایزا 76 3-7- اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم 77 3-8-تعیین Cut off در روش الایزا 80 3-9- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun 81 3-10- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun 82 3-11- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index IgG 82 3-12- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و PUET-GRA6 83 3-13- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری EUROIMMUN 83 3-14- اندازه گیری IgG Avidity Index با استفاده از کیت تجاری Microgen 85 3-15- محاسبه اندکس اویدیته نسبی (RAI) Relative avidity Index 88 3-16- کنترل کیفی 88 3-16-1- حساسیت 88 3-17-طراحی تحقیق 88 3-18- تعداد نمونه و روش نمونه گیری 89 3-18-1- تعداد نمونه 89 3-18-2- روش نمونه گیری 89 فصل چهارم: نتایج آزمایشات 4-1 :تهيه و تخليص پروتئين هاي نو تركيب rGRA7 (pUET-GRA7 و rGRA6 (PUET-GRA6 92 4-2- تایید هویت پروتئین های تخلیص شده با روش وسترن بلات 93 4-3- بررسیIgG,IgM,IgG Avidity نمونه های سرمی با کیت استاندارد Euroimmun 94 4-3-1- نتیجه آزمایشات IgG ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای ایرانی با کیت Euroimmun.. . 95 4-3-2- نتیجه آزمایشات IgM ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرمهای با کیت Euroimmun 95 4-3-3-نتیجه آزمایشات IgG Avidity ELISA مخصوص توکسوپلاسما سرم ها با کیت Euroimmun 96 4-4- برقراری شرایط ELISA Avidity با پروتئین های نوترکیب 100 4-5- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA6 برای تمایز عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار 103 4-6- نتایج آزمایش Avidity ELISA با استفاده از پروتئین نوترکیب GRA7 برای تمایز عفونت حاد ومزمن در سرم های زنان باردار ایران 103 4-7- بررسی نتایج ناهمخوان بین الایزا اویدیته با پروتئین های GRA6 وGRA7 و کیت Euroimmun با استفاده از کیت Microgen 104 فصل پنجم:بحث، پیشنهادات منابع 121 خلاصه انگلیسی 127 ضمائم 129 فهرست جداول عنوان صفحه جدول3-1: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن 87 جدول 4-1: نتایج آزمایشات Avidity ELISA,IgG,IgM سرم ها با کیت Euroimmon 97 جدول 4-2: بررسی نتایج ناهم خوان با کیت های Microgen,Euroimmun و پروتئین های GRA6 وGRA7 106 جدول شماره 4-3: نتایج آزمایش IgG وIgG Avidity با پروتئین های GRA6 و GRA7 بر روی سرم های زنان باردار 108 فهرست شکل ها عنوان صفحه شکل1-1- شكل شماتیك یك تاكی زوایت و یك برادی زوایت توكسوپلاسما گوندی 4 شکل1-2- عكس میكروسكوپ الكترونی یك تاكی زوایت، سوش VEGكه در حال نفوذ به یك نوتروفیل صفاق موش می باشد 7 شکل1-3- عکس میکروسکوپ الکترونی از تاکی زوایت سوش VEG در حال تقسیم اندودیوژنی داخل ماکروفاژ صفاق موش 8 شکل1-4- یك كیست بافتی توكسوپلاسما كه حاوی بیش از هزار برادی زوایت می باشد 9 شکل 1-5- راه های انتقال انگل توکسوپلاسما گوندی در میزبان اصلی و حد واسط 16 شکل 1-6- دختری با هیدروانسفالی بعلت توکسوپلاسموز مادرزادی 25 شکل 1-7- شکل شماتیک انواع الایزا38 شکل3-1:نوارهای کیت میکروژن87 شکل 4-1 : تخلیص پروتئین GRA6 به روش کروماتوگرافی تمایلی 92 شکل 4-2: تخلیص پروتئین GRA7 به روش کروماتوگرافی تمایلی 93 شکل 4-3: بررسی هویت آنتی ژنیسته پروتئین های GRA6 وGRA7 تخلیص شده باروش وسترن بلات 94 شکل 4-4 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 101 شکل 4-5 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA6 101 شکل 4-6 : تعیین غلظت بهینه اوره برای تفکیک سرمهای فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7 102 شکل 4-7 : تعیین زمان بهینه شستشو با محلول اوره به منظور تفکیک سرم های فاز حاد از مزمن عفونت توکسوپلاسما در آویدیته الایزا با استفاده از پروتئین GRA7 102 شکل4-8: مدلی از بلوغ آنتی بادی های IgG به آنتی ژن های توکسوپلاسمای 105 شکل 4-9: نتایج کیت میکروژن 106 شکل4-10: مقایسه اجرای تست Avidity با کیت Euroimmun و پروتئین GRA6 برای افتراق عفونت حاد و مزمن و تحت حاد107 Abbreviations: AC- Affinity chromatography ADCC – Antibody – Dependent Cell – Mediated Cytotoxicity AIDS – acquired immunodeficiency syndrome APS – Ammonium persulfate BAG – bradyzoite antigen BCA – bicinchoninic acid assay BSA – bovine serum albumin CSF – Cerebrospinal fluid CD – cluster of differentiation DAB – Diamino benzidine DNA – Deoxyiribonucleic acid EDTA – Ethylenediaminetraacetic acid ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay EI – Enzyme immunoassay FPLC – Fast protein liquid chromatography FSH – Follicle – stimulating hormone FDA – Food and drug Administration GRA – granule antigen GST – glutathione S-transferase HCG – Human chorionic gonadotropin HIS-TAG – histidine-tag IEC – Ion-exchange chromatography IMAC – immobilized – metal affinity chromatography IPTG – Isoproyl –B-D-thio-galactoside Ig – immunoglobulin IFN- Interferon IL – interleukin LH- Luteinnizing hormone MBP – Maltose Binding Protein MAG – Matrix antigen MIC – Microneme NI-NTA – Nikel nitrilotriacetic acid OD – Optical density OPD – o – phenylenediaminedihydrochloride PBS – Phosphate – bufferedsaline PSA- Prostate – specific antigen PV – Parasitophorus vacuole PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis PCR – Polymerase chain reaction RAI – Relative avidity index ROP – Rhoptry protein RNA – Ribonucleid acid SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SAG – surface antigen TBS – Tris buffered Saline TEMED – Tetramethylenediamine TMB – Tetra Methyl Benzidine Th – T –helper TRX – Thioredoxin TSH – Thriod – Stimulating hormone TNF – Tumor necrosis factor چکیده فارسی توکسوپلاسموزیس که توسط انگل اجباری درون سلولی توکسوپلاسما گوندی، ایجاد می شود. در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، عفونت اولیه معمولاً بدون علائم ویا با عوارض خفیفی همراه است، ولی در نوزادانی که عفونت را به طور مادرزادی دریافت کرده اند، ممکن است منجر به عوارض خطرناکی مثل عقب ماندگی ذهنی، کوری و یا حتی مرگ شود. بنابراین تشخيص صحيح عفونت اخير (recent) توكسوپلاسما و تمايز آن از عفونت مزمن در زنان باردار، اهميت حياتي در مراقبتهاي درماني مادر و جلوگيري از بروز عوارض عصبي- مغزي در جنين دارد. از آنجایی که پاسخ آنتی بادی های IgM در درصد قابل ملاحظه ای از افراد، ماه ها یا حتی سال ها پس از کسب عفونت، مثبت باقی می ماند، تمایز صحیح میان عفونت حاد و مزمن به ویژه در زنان باردار، اهمیت فوق العاده ای دارد. در حال حاضر، بنظر مي رسد تركيب دو روش الايزاي IgM و الايزاي آويديته IgG بهترين و مطمئن ترين نتايج را براي تشخيص عفونت حاد و تمايز آن از عفونت مزمن مي دهند. شرایط بهینه روش IgG avidity ELISA برای تمایز سرم ها از عفونت حاد ومزمن با استفاده از دو پروتئين GRA7 وGRA6 برقرار (develop) شد. در نهایت ،كارايي روش avidity ELISA با استفاده از دو پروتئین فوق براي تشخيص عفونت حاد و مزمن در زنان باردار بررسی شد. در این تحقیق از کیت استاندارد Microgen جهت مقایسه نتایج ناهمخوان مابین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 وGRA7 استفاده شد، نتایج بدست آمده از کیت Microgen دقیقا شبیه با پروتئین های نوترکیب بود. دراين تحقيق از 21 سرم حاد و 28 سرم مزمن و 29 سرم تحت حاد زنان مبتلا به توکسوپلاسما كه حاد و مزمن وتحت حاد بودن آن با استفاده از تست هاي استاندارد سرولوژيك براي ما مشخص شده بود استفاده شد . از21 سرم حاد در آویدیته الایزا با پروتئين GRA6 ، تنها 1 سرم آویدیته بالا داشت و از 28 سرم مزمن ، 2سرم آویدیته پایین داشت و از 29 سرم تحت حاد 5 سرم آویدیته پایین داشتند. در آزمايش با پروتئين GRA7 از 21 سرم حاد، 1 سرم آويديته بالا داشتند و از 28سرم مزمن همه سرم ها آويديته بالا داشتند و از 29 سرم تحت حاد ، 6 سرم آویدیته پایین داشتند.همچنین در این تحقیق تعدادی از سرم ها که نتایج ناهمخوانی ما بین کیت Euroimmun و پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7داشتند را با استفاده از کیت استاندارد Microgen بررسی کردیم که نتایج این کیت استاندارد شبیه پروتئین های نوترکیب GRA6 و GRA7بخصوص پروتئین GRA6 بود که این یافته ها کارایی بهتر GRA6 را نشان می دهد. استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب به جای آنتی ژنهای توتال انگل در کیت تشخیصی آویدیته الایزا ممکن است منجر به افزایش کارایی آنها شده و استانداردسازی کیتها را نیز تسهیل کند. کلمات کلیدی : توکسوپلاسما،گوندی ،آویدیته الایزا ، GRA7 ،GRA6 مقدمه تاریخچه و طبقه بندی انگل توکسوپلاسما گوندی، یکی از اعضای شاخه اپی کمپلکسا، راسته کوکسیدیا، انگل اجباری درون سلولی بوده که بیماری توکسوپلاسموزیس را ایجاد می کند.این انگل با گسترش جهانی، قادر به تکثیر در بسیاری از میزبان های مهره دار از جمله انسان است. این ارگانیسم در سال 1908 توسط نیکول و مانسو در یک جونده کوچک به نام کتنوداکتیلوس گوندی در انستیتو پاستور تونس و تقریباً به طور همزمان توسط اسپلندور در برزیل در یك خرگوش آزمایشگاهی کشف شد. ابتدا تصور می شد این ارگانیسم گونه ای از جنس لیشمانیا است ولی یک سال بعد، پس از مطالعات بیشتر آن را به عنوان یک ارگانیسم متفاوت شناختند و نام جنس جدید توکسوپلاسما را برای آن پیشنهاد کردند)1و2(. اگرچه توكسوپلاسما گوندی عوارض متعددی در انسان بوجود می آورد ولی 15 سال بعد از کشف آن بود كه انگل از اتوپسی چشم یك كودك مبتلا به هیدروسفالی جدا شد)3و4(. شیوع توكسوپلاسموزیس تا قبل از ابداع روش تشخیص سرولوژیكی تست رنگی به وسیله سابین و فلدمن در 1948 )5(، به طور دقیق مورد ارزیابی قرار نگرفت. فرنکل در سال 1970 چرخه زندگی را به طور کامل شناسایی و معرفی کرد )1(. موقعیت تاكسونومیك توكسوپلاسما گوندی بر اساس خصوصیات شكل شناسی و چرخه انگلی آن به وسیله ملهورن در سال 1988 به صورت زیر تعریف شده است. دریافت فایل جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید |